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Diffusion membranaire du récepteur de la glycine

par Pierre-Louis Porté - 7 mai 2007

La glycine est un des deux principaux neurotransmiteurs inhibiteurs. La plasticité synaptique (modification de l’efficacité synaptique au cours du temps) dépend directement du nombre de récepteurs disponibles dans la zone postsynaptique. On souhaite comprendre alors le rôle de la diffusion membranaire dans la régulation du nombre de récepteurs de la glycine au cours du temps.

A l’aide de nanocristaux semiconducteurs fluorescents, il est aujourd’hui possible de suivre le mouvement de récepteurs individuels pendant des durées de plusieurs dizaines de minutes. L’utilisation de ces sondes peut alors nous permettre non seulement de caractériser le mouvement diffusif de récepteurs individuels et ainsi de distinguer plusieurs types de population mais encore de voir des changements de comportement d’un même récepteur au cours du temps.

Nous avons ainsi caractérisé leur mouvement diffusif dans la membrane neuronale. Ces mesures en fluorescence ont été complétées par des images de microscopie électronique permettant la localisation des particules avec une résolution nanométrique.

1. Le récepteur de la glycine : généralités et questions posées

1.1. Structure du récepteur de la glycine

La glycine est un des deux principaux neurotransmiteurs inhibiteurs. Le récepteur associé fonctionne comme un canal pour les ions chlore dont le passage sert à hyperpolariser la membrane neuronale. Le récepteur de la glycine est une protéine pentamérique (3 sous-unités alpha et 2 sous-unités beta) insérée dans la membrane ; les membranes cellulaires étant des bi-couches lipidiques fluides au sein desquelles les protéines membranaires peuvent diffuser.

Au niveau des membranes post-synaptiques, les récepteurs sont généralement accumulés en face des terminaisons pré-synaptiques contenant le neurotransmetteur correspondant. Les RGly sont concentrés en microdomaines membranaires fonctionnels en face des zones pré-synaptiques actives. La formation de ces domaines est rendue possible grâce à des interactions avec des structures submembranaires. En effet, en l’abscence de ces structures, les récepteurs diffusent librement dans la membrane. La stabilisation a lieu grâce a une liaison réversible avec une protéine d’ancrage cytoplasmique : la géphyrine qui interagit d’une part avec la sous unité beta du récepteur et d’autre part avec des molécules du cytosquelette, les microtubules.

1.2. Pourquoi étudier la diffusion latérale du RGLy ?

L’une des questions actuelles de la neurobiologie concerne les mécanismes de la synaptogénèse, moment de la formation des synapses, et ceux de la plasticité synaptique, c’est à dire comment l’efficacité d’une jonction synaptique peut être modifiée au cours du temps. Notons que la plasticité cellulaire joue certainement un rôle clé dans les processus d’apprentissage et de mémoire. On sait que l’efficacité de la transmission synaptique dépend du nombre de récepteurs présents au niveau des sites post-synaptiques. Une hypothèse actuelle est que ce nombre pourrait réciproquement la réguler. Ainsi une modification à long terme de l’efficacité synaptique pourrait naître d’une modification de l’équilibre entre les récepteurs diffusant librement, les récepteurs piégés par la géphyrine et ceux en train d’être recyclés par endocytose. Pour avancer dans la compréhension des phénomènes mis en jeu, il paraît donc très utile d’étudier leur dynamique latérale, c’est à dire comment les récepteurs, libres ou agrégés, diffusent dans la membrane et comment ils sont stabilisés au niveau des synapses.

1.3. Mécanisme de diffusion-capture

L’analyse de la diffusion du RGly dans la membrane post-synaptique en vidéomicroscopie sur cellules vivantes a permis de montrer qu’il alterne entre des phases de diffusion libre et rapide dans la membrane et des phases de confinement liées à l’interaction avec la géphyrine. Il a été ainsi démontré l’importance du mécanisme de diffusion capture dans l’organisation membranaire du GlyR.

2. Techniques utilisées

2.1. Cultures

Toutes les cultures (que ce soit des cultures de neurones ou des entretients de lignées de cellules) s’effectuent au Laboratoire de Biologie Cellulaire de la Synapse, ENS Biologie. Les cultures de neurones sont des cultures d’interneurones spinaux de rats (à partir d’embryons de 14 jours).

2.2. Marquage du RGLy

Pour assurer une liaison spécifique entre le RGLy et un nanocristal unique, on utilise un ou plusieurs anticorps intermédiaires.


Dans les neurones, marquage de la sous-unité alpha1 du RGly	Dans les cellules fibroblastes, marquage du tag myc des RGly transféctés

2.3. Montage d’épifluorescence

Résolution optique : environ 250 nm Le montage est également équipé d’un système à air permettant de réguler la température

2.4. Traitement d’image

Pour comprendre les techniques permettant d’obtenir, à partir des films dont on a fait l’aquisition, les trajectoires de nanocristaux individuels (Single Particle Tracking), se reporter au projet de recherche "Analyses d’images pour le suivi d’objets individuels".

Notons cepandant que l’on obtient, après traitement d’image, une précision de localisation de l’ordre de 10 nm (qui dépend de la longueur d’onde d’émission des nanocristaux et de l’intensité avec laquelle on les éclaire).

2.5. Mesure des coefficients de diffusion

En faisant l’hypothèse que les protéines membranaires ont un mouvement de type diffusif brownien (libre, dirigé ou confiné), on peut obtenir leur coefficient de diffusion en calculant la fonction de déplacement quadratique moyen (Mean Square Displacement en anglais).

Voici un exemple de trajectoire réelle ayant un mouvement brownien libre et le calcul de la MSD correspondante avec la régression linéaire aux temps courts permettant d’évaluer le coefficient de diffusion (1/4 de la pente).

3. Etude de la dynamique du RGly

3.1. Dans des neurones

Après avoir réussi à caractériser la dynamique latérale du RGly en fonction de sa localisation (synaptique, perisynaptique ou extrasynaptique) dans des neurones de moelle épinière de rat, nous nous intéressons à ses modifications sous l’effet de drogues (TTX, strychnine, Gabazine, APV, cnqx) pour comprendre comment s’effectue sa régulation. Ces études sont en cours.

Exemple de film :

Image en transmission	Image FM	Nanocristaux

Sur l’image de droite, on a les trajectoires avec en fond l’image en transmission des neurones et l’image seuillée (en rouge) du marquage des synapses (au FM 4-64).

On obtient au final les trajectoires suivantes (en bleu les récepteurs extrasynaptiques, en vert les synaptiques et en jaune les perisynaptiques), à partir desquelles on peut alors calculer les coefficients de diffusion, et les temps de passage aux synapses.

Quelques résultats :

Ici sont représentées les courbes cumulatives empiriques des coefficients de diffusion obtenus pour des récepteurs extrasynaptiques dans des conditions controles (sans ajout de drogues, conditions les plus proches du milieu de culture) et en présence de TTX.

Collaborations

Ce travail béneficie d’une collaboration avec Sabine Lévi et Antoine Triller (Laboratoire de Biologie Cellulaire de la Synapse, ENS Biologie) et d’une collaboration avec Stéphane Bonneau et Laurent Cohen (CEREMADE, Université de Paris-Dauphine) pour la partie traitement d’image.

3.2. Dans des cellules Hela

3.2.1. Pourquoi se tourner vers des cellules modèles ?

L’étude de la dynamique du Rgly dans les cultures de neurones soulèvent quelques problèmes :
d’un point de vue technique, il est difficile de localiser précisément les synapses du fait du marquage par le FM 4-64 qui est assez diffus et bleach rapidement. Ainsi, les mesures de temps de résidence et la localisation précise des synapses est délicate.
du point de vue de l’interprétation, on a affaire à un système complexe et il est difficile d’attribuer un effet observé à une cause précise.

Avant de revenir aux neurones en culture (qui, quoi qu’il en soit reste le système dont on souhaite comprendre les mécanismes), on va donc se pencher sur des systèmes modèles, des cellules fibroblastes dans lesquelles on pourra faire exprimer sélectivement les protéines que l’on souhaite étudier. Ainsi, une fois que l’on aura obtenu les grandeurs nous intéressant, on aura à disposition des valeurs de référence que l’on pourra comparer par la suite avec celles que l’on obtiendra (ou que l’on a déjà obtenu) pour les neurones.

3.2.2. Caractérisation de l’intéraction RGLy-géphyrine

Pour réduire le nombre d’acteur intervenant dans la régulation de la dynamique du Rgly et ainsi se concentrer sur l’interaction entre le RGLy et sa protéine d’ancrage qu’est la géphyrine, l’utilisation de cellules modèles comme les cellules Hela (ou les COS ou les HEK) est un bon outil.

En effet, l’utilisation de cellules fibroblastes donnant la possibilité de faire exprimer ou non (par transfection) de la géphyrine – YFP et du RGLy a1 ou a1-bgb, on va pouvoir caractériser précisément la dynamique du Rgly avec et sans protéine d’ancrage. Tout d’abord, on comparera les valeurs que l’on obtiendra avec celles déjà obtenues avec des billes.

La localisation de la géphyrine (marquée avec une YFP très brillante) devrait être plus facile et plus précise que dans le cas du marquage des synapses (avec le FM, on marquait des vésicules, mobiles, dans la zone présynaptique). Tout cela devrait alors rendre possible la caractérisation de l’intéraction entre le Rgly et la géphyrine.

3.2.3 Quelques images obtenues avec des cellules Hela

La transfection fonctionne sur les cellules Hela :

Sur un champ de 110*110 microns, on peut voir içi 2 cellules cotransfectées (en gephyrine et en RGLy contenant la boucle d’interaction avec la géphyrine) et 1 cellule non transféctée. La prise d’image est faite sur cellules fixées.


Image en transmission	Géphyrine (YFP)	RGly (marqué avec un anticorps couplé à un fluorophore)

Le couplage anticorps-nanocristal fonctionne :

On peut voir içi, sur cellules vivantes, que notre marqueur fonctionne bien. Le marquage non spécifique est marginal et coincide la plupart du temps avec un débris sur la lame.


Image en transmission	Géphyrine (YFP)	RGLy marqué par des nanocristaux dans le régime de la molécule unique

Exemple de film :

Ce film fait 512 images prises à une cadence de 13Hz (1 toute les 75ms) sur un champ d’environ 28*28 microns. Notez le scintillement des nanocristaux qui garantit que celui-ci est unique.


Image en transmission	Géphyrine (YFP)	Film : RGLy

3.2.4. Collaborations

Ce travail béneficie d’une collaboration avec Cyril Hanus et Antoine Triller (Laboratoire de Biologie Cellulaire de la Synapse, ENS Biologie) et d’une collaboration avec Stéphane Bonneau et Laurent Cohen (CEREMADE, Université de Paris-Dauphine) pour la partie traitement d’image.