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Étude des interactions ADN-protéine

par Pierre-Louis Porté - 27 février 2007

Présentation

Nous étudions à l’échelle de la molécule individuelle et par microscopie de fluorescence, les interactions entre de l’ADN peigné et/ou étiré et les enzymes de restriction de type II EcoRI et EcoRV. Ces enzymes jouent un rôle important dans la protection des bactéries contre les virus : elles détruisent l’ADN viral en le coupant en des sites spécifiques, empêchant ainsi son insertion dans la génôme bactérien et sa transcription. Les biochimistes ont montré que les enzymes de restriction sont capables de localiser leur séquence-cible avec une efficacité remarquable. Une diffusion brownienne tridimensionnelle de l’enzyme ne permet pas d’expliquer la rapidité observée pour ce processus. Un mécanisme de diffusion linéaire de l’enzyme le long de l’ADN a donc été proposé voilà quelques années (pour une revue, voir N. Shimamoto "One dimensional Diffusion of Proteins along DNA", J. Biol. Chem 274, 1990). L’observation directe de la dynamique de ce processus en microscopie de fluorescence demeure cependant un défi expérimental sur lequel travaillent actuellement plusieurs équipes dans le monde. Pour atteindre cet objectif, les molécules d’ADN doivent être placées dans une configuration permettant à la fois leur observation et leur interaction avec des protéines. Il s’agit également de coupler les protéines d’intérêt avec des fluorophores en conservant leur activité.

Etirer l’ADN

En solution, les molécules d’ADN sont sous forme de pelotes. La première étape consiste donc à déplier les molécules d’ADN. Nous utilisons pour cela deux techniques :

le peignage, méthode mise au point au laboratoire de Physique Statistique de l’ENS (Bensimon A., Simon A, Chiffaudel A, Croquette V, Heslot F and Bensimon D., 1994. Science, 265). Cette technique consiste à plonger une lamelle de verre rendue hydrophobe dans une solution de bas pH contenant de l’ADN. Les molécules d’ADN s’accrochent par au moins une de leurs extrémités à la surface et, lorsque la lame est retirée, elles se déplient, et s’étirent sur la surface. Les molécules d’ADN peignées sont alors dans une configuration linéaire et surétirée (150 % de leur longueur cristallographique). Il est possible de réhydrater ces molécules, qui conservent néanmoins de nombreux points de contact avec la surface.


Principe du peignage de molécules d’ADN	Observation en microscopie de fluorescence d’ADN peigné par évaporation de microgouttes (1 µL)

Nous peignons également l’ADN en laissant s’évaporer des microgouttes déposées sur des lames hydrophobes. Le principe est le même : pendant l’évaporation, les molécules d’ADN sont dépliées par le passage du ménisque. Certaines enzymes peuvent interagir avec de l’ADN peigné. Néanmoins les interactions ADN-protéines sont probablement modifiées par la proximité de la surface et le surétirement de l’ADN. C’est pourquoi nous avons développé une technique voisine pour nous affranchir de ces problèmes :

l’étirement permet d’étirer une molécule d’ADN en l’accrochant spécifiquement par ses extrémités à une surface. Pour cela, une solution d’ADN est injectée dans une cavité à écoulement. L’accrochage des molécules d’ADN repose sur le même principe que le peignage, mais leur étirement est obtenu par l’application d’un flux hydrodynamique dans la cavité. Dans la configuration obtenue, l’ADN n’est pas surétiré, et n’a pas de point d’ancrage sur la surface autre que ses extrémités. Cette configuration est donc potentiellement plus favorable que celle résultant du peignage pour observer l’interaction molécule d’ADN/protéines. Nous avons récemment étudié le mouvement de fluctuations transverses des molécules d’ADN étirées.


Principe de l’étirement de l’ADN sous l’action d’un flux hydrodynamique	Fluctuations transverses d’ADN étiré et teinté au YOYO.

Ces deux techniques permettent d’utiliser la microscopie de fluorescence par onde évanescente pour observer les interactions des enzymes avec l’ADN. Contrairement à la microscopie en épifluorescence, cette technique limite l’excitation lumineuse à une zone située au voisinage de la surface ( 100 nm). La concentration en enzymes de la solution peut rester élevée, seule la fluorescence des enzymes au voisinage de la surface est récoltée. Le rapport signal/bruit est donc augmenté.

Visualisation des extrémités de l’ADN

Afin de visualiser l’ADN par microscopie de fluorescence, ce dernier est souvent teinté à l’aide d’un intercalant (YOYO) ou d’un ligand du grand sillon (SyBr). Ces colorants ont des inconvénients dans nos expériences : ils interfèrent avec l’activité enzymatique et leur photobleaching (destruction par la lumière) endommage l’ADN peigné ou étiré, provoquant la cassure de la molécule. Nous avons mis au point une technique qui nous permet de détecter les extrémités de molécules d’ADN peigné ou étiré avec des nanocristaux semi-conducteurs (quantum dots). Ces sondes fluorescentes, très brillantes, ne sont pas détruites par la lumière. Le couplage étant spécifique et efficace, cette méthode est une alternative prometteuse à la coloration usuelle de l’ADN dans les expériences de molécules uniques.

Molécules d’ADN peignées sur une surface hydrophobe. Ce plasmide d’une dizaine de kbp a été teinté avec l’intercalant YOYO1 (en vert sur l’image), puis révélé à l’aide de nanocristaux attachés de manière spécifique à ses extrémités (en rouge sur l’image).

Couplage des enzymes aux fluorophores

Une autre étape indispensable à la visualisation de l’interaction ADN-protéine consiste à coupler l’enzyme à un ou quelques fluorophore(s) pour permettre son observation, tout en préservant son activité.

Nous disposons d’enzymes EcoRV biotinylées, généreusement fournies par l’équipe d’A. Pingoud. Ces enzymes EcoRV sont des mutantes pour lesquelles l’unique cystéine (utilisée pour le greffage de la biotine), proche du site actif dans l’enzyme sauvage, a été déplacée afin de préserver la pleine activité de l’enzyme. Nous sommes ainsi parvenus à coupler des streptavidine-Cy3 et des nanocristaux streptavidine (605nm) à ces enzymes biotinylées.

Publications

"Transverse fluctuations of single DNA molecules attached at both extremities to a surface", A. Crut, D. Lasne, J.F. Allemand, M. Dahan, P. Desbiolles, Phys. Rev. E 67 051910 (2003)

"Sequence-specific fluorescent labeling of double-stranded DNA observed at the single molecule level", B. Géron-Landre, T. Roulon, P. Desbiolles and C. Escudé, Nucleic Acid Res. 31, e125 (2003).

"Detection of single DNA molecules by multicolor quantum-dot end-labeling", A. Crut, B. Géron-Landre, I. Bonnet, S. Bonneau, P. Desbiolles and C. Escudé, Nucl. Acid Res. 33 e98 (2005).